Микроскопия отделяемого

Микроскопия отделяемого

Микроскопическое исследование

Для проведения микроскопического исследования мазки высушивают на воздухе, фиксируют и после этого окрашивают.
Приготовление мазков
Исследуемый материал распределяют тонким слоем по поверхности предметного хорошо обезжиренного стекла. Влагалищное отделяемое, нанесенное на предметное стекло ближе к узкому краю, накрывают другим предметным стеклом. Стекла слегка придавливают друг к другу.
После этого свободные концы стекол захватывают I и II пальцами обеих рук и разводят в противоположные стороны так, чтобы при движении оба стекла плотно прилегали друг к другу. Таким образом, получаются мазки с равномерно распределенным материалом.
Высушивание и фиксирование мазков
Приготовленный на предметном стекле мазок высушивают на воздухе и после полного высыхания фиксируют. При фиксировании мазок закрепляется на поверхности предметного стекла, и поэтому при последующей окраске препарата микробные клетки не смываются. Кроме того, убитые микробные клетки окрашиваются лучше, чем живые.
Различают физический способ фиксации, в основу которого положено воздействие высокой температуры на микробную клетку, и химические способы, предусматривающие применение химических средств, вызывающих коагуляцию белков цитоплазмы.
— Физический способ фиксации
Предметное стекло с препаратом берут пинцетом или I и II пальцами правой руки за ребра мазком кверху и плавным движением проводят 2-3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации должен занимать не более 2с. Надежность фиксации проверяют следующим приемом: свободную от мазка поверхность предметного стекла прикладывают к тыльной поверхности левой кисти. При правильном фиксировании мазка стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущения ожога.
— Химический способ фиксации
Для фиксации мазков применяют также химические вещества и соединения — этиловый (винный) спирт 960, ацетон, смесь Никифорова (смесь спирта и наркозного эфира в соотношении 1:1), жидкость Карнуа (спирта 96% 60 мл, хлороформа 30 мл, ледяной уксусной кислоты 10 мл).
Предпочтительнее считается щадящая химическая фиксация (ацетон, смесь Никифорова, жидкость Карнуа) [15].
Предметное стекло с высушенным мазком погружают в склянку с фиксирующим веществом на 10-15 минут и затем высушивают на воздухе.
Далее проводится классическая окраска мазка по методу Грама. Для проведения этой окраски могут быть использованы специальные комерческие красители, например, фирмы BioMerioux или красители, приготовленные непосредственно в лаборатории.
Окраска по Граму
Окраска по Граму относится к сложному способу окраски. При сложных способах окраски на мазок воздействуют двумя красителями, из которых один является основным, а другой – дополнительным. Кроме красящих веществ, при сложных способах окраски применяют различные обесцвечивающие вещества: спирт, кислоты и т.д.
Особенностью окраски по Граму является неодинаковое отношение различных микроорганизмов к красителям трифенилметановой группы: генциановому, метиловому или кристаллическому фиолетовому. Микроорганизмы, входящие в группу грамположительных (Грам+), например стафилококки, стрептококки, дают прочное соединение с указанными красителями и йодом. Окрашенные микроорганизмы не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, вследствие чего при дополнительной окраске фуксином Грам(+) микроорганизмы не изменяют первоначально принятый фиолетовый цвет. Грамотрицательные (Грам-) микроорганизмы (бактероиды, фузобактерии и др.) образуют с генциановым кристаллическим или метиленовым фиолетовым и йодом легко разрушающееся под действием спирта соединение, в результате чего они обесцвечиваются и затем окрашиваются фуксином, приобретая красный цвет.
Отношение микроорганизмов к окрашиванию по Граму имеет большое диагностическое значение.
Приготовление растворов
Кристаллический фиолетовый (фуксин Циля карболовый) – карболовый раствор: 1г кристаллического метилового фиолетового растирают в фарфоровой ступке с 5г кристаллической карболовой кислоты и несколькими каплями глицерина. Во время растирания небольшими порциями прибавляют 10 мл спирта. После того как краситель хорошо разотрется, прибавляют при постоянном помешивании 100 мл дистиллированной воды. Раствор красителя фильтруют через влажный бумажный фильтр. Фуксин очень стойкий и может храниться долгое время во флаконе темного стекла с притертой пробкой.
Раствор Люголя – 2г йодида калия растворяют в 5-10 мл дистиллированной воды, затем прибавляют 1г кристаллического йода, оставляют на несколько часов до полного его растворения и после этого приливают приливают 295-290 мл дистиллированной воды.
Фуксин спирто-водный (раствор Пфейфера) – к 1 части карболового фуксина Циля приливают 9 частей дистиллированной воды. Раствор очень не стойкий, поэтому его готовят в небольших количествах непосредственно перед употреблением.
Методика окраски
1.    Фиксированный мазок окрашивают через фильтровальную бумагу основным красителем – раствором основного карболового кристаллического фиолетового. Прокрашивание длится 1-2 минуты.
2.    Снимают бумагу, сливают избыток красителя и, не промывая препарата водой, наливают раствор Люголя на 1-2 минуты до почернения препарата.
3.    Раствор Люголя сливают. Предметное стекло для обесцвечивания мазка погружают несколько раз в стаканчик со спитртом, процесс обесцвечивания считается завершенным, когда от мазка перестают отделяться окрашенные в фиолетовый цвет струйки жидкости.
4.    Препарат тщательно промывают водопроводной водой.
5.    Докрашивают спирто-водным раствором фуксина.
 
Прокрашивание длится 1-2 минуты.
Результаты окраски
Грам(+) микроорганизмы окрашиваются основным красителем в темно-фиолетовый цвет, Грам(-), воспринимая дополнительную окраску, приобретают ярко-малиновый цвет.
К недостаткам этого метода окраски следует отнести определенные трудности при отнесении выявленных микроорганизмов к Грам(+) или Грам(-) по цвету из-за их неоднородного прокрашивания ввиду возможности присутствия в вагинальном мазке большого количества слизи и разнообразных продуктов жизнедеятельности микроорганизмов. В этой связи Мавзютов А. Р. и соавт. предложили использовать для микроскопической диагностики БВ окраску метиленовым синим [15].
Окраска метиленовым синим
Приготовление растворов:
•    Раствор «А»: 2,5 г кристаллического фиолетового растворить в 250 мл дистиллированной воды (годен 3-4 недели);
•    Раствор «Б»: 12,5 г натрия карбоната растворить в 250 мл дистиллированной воды (годен 2 нед., до выпадения кристаллов);
•    Раствор йода: 1 г натрия гидроксида растворить в 7 мл дистиллированной воды, затем добавить 5 г кристаллического йода и 0,25 к калия йодида, к полученному раствору добавить дробно 243 мл дистиллированной воды;
•    Смывная жидкость для обесцвечивания: 75 мл ацетона добавить к 175 мл этилового спирта;
•    Раствор сафранина: 5 г сафранина растворить в 15-20 мл этилового спирта и добавить до 250 мл дистиллированной воды.
 
Окраска мазков
1.    Мазки фиксируют над пламенем горелки. На свободную от исследуемнго материала часть стекла одновременно наносят по 6 капель растворов «А» и «Б». Смешивают стеклянной палочкой и равномерно распределяют по стеклу. Экспозиция – 2 мин.
2.    Удаляют остатки краски и наносят раствор йода на 2 мин.
3.    Удаляют остатки йода и наносят 10-20 капель смывной жидкости, повторяют манипуляцию до полного обесцвечивания, постоянно покачивая стекло.
4.    Промывают водопроводной водой.
5.    Докрашивают сафранином 2 мин.
6.    Промывают водой, просушивают, микроскопируют.
 
Результаты окраски
При использовании данной окраски происходит оптимальное прокрашивание препарата метиленовым синим грамположительной флоры в голубые тона и грамотрицательной — в интенсивный иссиня-черный цвет.
Непосредственную микроскопию лучше проводить под относительно небольшим увеличением (окуляр х 2-7) с целью увеличения поля зрения и максимального охвата всех присутствующих в материале объектов.
С учетом современных достижений клинической бактериологии и знаний инфекционной патологии женских половых органов Кира Е. Ф. в 1994 году была разработана оригинальная классификация микроскопической характеристики биоценоза влагалища, в которой представлена микроскопическая характеристика 4 типов биоценоза влагалища и соответствующие каждому типу нозологические формы:
Нормоценоз
Доминирование лактобактерий, отсутствие грамотрицательной микрофлоры, спор, мицелия, псевдогифов, наличие единичных лейкоцитов и единичных «чистых» эпителиальных клеток соответственно фазе менструального цикла.
Типичное состояние нормального биотопа влагалища.
Промежуточный тип
Умеренное или незначительное количество лактобактерий, наличие грамположительных кокков, грамотрицательных палочек. Обнаруживаются лейкоциты, моноциты, макрофаги, эпителиальные клетки.
Часто наблюдается у здоровых женщин, редко сопровождается субъективными жалобами и клиническими проявлениями.
Дисбиоз влагалища
 
Незначительное количество или полное отсутствие лактобактерий, обильная полиморфная грамотрицательная и грамположительная палочковая и кокковая микрофлоры; наличие «ключевых» клеток. Количество лейкоцитов вариабильно, отсутствие или незавершенность фагоцитоза. Полимикробная картина мазка.
БАКТЕРИАЛЬНЫЙ ВАГИНОЗ
Вагинит
Большое количество лейкоцитов, макрофагов, эпителиальных клеток, выраженный фагоцитоз, морфологический пейзаж воспалительного процесса.
Неспецифический вагинит
При обнаружении: гонококков, трихомонад, мицелия, псевдогифоф, спор выставляется соответствующий этиологический диагноз – Гонорея, Трихомониаз, Микотический вагинит [7, 8].
Предложенная классификация достаточно проста и информативна, так как сочетает в себе микробиологическую интерпритацию влагалищного мазка, характеристику клинической картины и соответствующую нозологическую форму.
Наиболее важное диагностическое значение при БВ имеет выявление «ключевых» клеток.
Формирование «ключевых» клеток происходит в случае увеличения колонизации G.vaginalis и последующей их адгезии на клетки вагинального плоского эпителия. Таким образом «ключевые» клетки представляют собой отторгшиеся от эпителиальной выстилки интактные или литически измененные клетки, колонизированные G.vaginalis. G.vaginalis покрывают всю поверхность эпителиальных клеток в виде облака или вуали, а в наиболее клинически выраженных случаях заполняют собой все межклеточное пространство. Однако, выявление «ключевых» клеток при микроскопии влажного неокрашенного мазка увеличивает вероятность получения ложноположительного результата, так как часто «ложноключевые» клетки (эпителиальные клетки с адгезированными на них лактобактериями) отождествляют с истинными, что ведет к гипердиагностике БВ. Некоторые авторы считают, что более достоверную информацию можно получить при микроскопии вагинальных мазков, окрашенных по методу Грама, когда «ключевые» клетки легко дифференцировать с «ложноключевыми». Чувствительность микроскопического метода диагностики составляет 93%, а специфичность 70% [6]. Микроскопический метод позволяет оценить не только морфологические особенности и соотношение отдельных компонентов вагинальной микрофлоры, но и получить информацию о состоянии слизистой влагалища и наличии лейкоцитарной реакции макроорганизма.
Количественный критерий обнаружения «ключевых» клеток остается дискутабельным, поскольку до настоящего времени окончательно не решен вопрос о показаниях нормы для микрофлоры влагалища. Вместе с тем, общепризнанным является факт превалирования в норме бактерий рода Lactobacillus, что позволило использовать его в качестве основного при исследовании БВ. В пользу указанного свидетельствует невозможность чрезмерного развития сопутствующей флоры, а следовательно и наличие «ключевых» клеток, при сохраненном количественном уровне лактобактерий. Это автоматически исключает подщелачивание среды влагалища и т.д., характерные для БВ. В настоящее время существует несколько микроскопических классификаций БВ.
Мавзютов А. Р. и соавт. предложили дифференцирование БВ по трем степеням:
1 степень – компенсированный, для которого характерно полное отсутствие в исследуемом материале микрофлоры при неизмененных эпителиоцитах. Указанное состояние слизистой влагалища не рассматривается в качестве патологического, но отсутствие лактобактериальной флоры свидетельствует о принципиальной возможности заселения пустующей экологической ниши попадающими с наружных половых органов микроорганизмами и последующим формированием БВ ввиду нарушения на фоне отсутствия лактобактерий естественной колонизационной резистентности слизистой. Описанные формы могут наблюдаться при микроскопии в результате «чрезмерной» подготовки пациентки к посещению врача или же после проведения интенсивной химиотерапии антибактериальными препаратами широкого спектра действия (Цефалоспорины, макролиды и т.п.).
2 степень – субкомпенсированный, характеризующийся количественным снижением лактобактерий, соизмеримым с возрастанием количества сопутствующей грамвариабельной полиморфной бактериальной флоры, и появлением в поле зрения единичных (1-5) «ключевых» клеток при относительно умеренном лейкоцитозе (15-25 в поле зрения). «Ключевые» клетки могут быть представлены как покрытыми бактериальной флорой снаружи эпителиоцитами, так и содержащими бактерии внутриклеточно ввиду неспецифического осуществления эпителиальными клетками функций фагоцитоза.
3 степень – декомпенсированный, являющийся клинически выраженным в соответствии с симптоматикой БВ и микроскопически характеризующийся полным отсутствием лактобактерий, когда все поле зрения заполнено «ключевыми» клетками. Бактериальная флора при этом может быть представлена самыми различными, за отсутствием лактобактерий, микроорганизмами как в монокультуре, так и в различных морфо- и видовых сочетаниях [15].
Одним из методов лабораторной диагностики, который позволяет в полной мере оценить качественные и количественные характеристики микрофлоры влагалища является бактериологическое исследование. C развитием этого метода изменялось и представление о составе микрофлоры влагалища. Усовершенствование бактериологического метода диагностики – улучшение качества питательных сред, методов культивирования, различных техник выделения и идентификации микроорганизмов способствовали изменению представлений о критериях нормы. Первоначально было установлено, что наряду с лактобактериями в составе нормальной микрофлоры могут быть и условно-патогенные микроорганизмы (стафилококки, стрептококки, некоторые грамотрицательные бактерии) [13, 14]. Внедрение с начала 70-х годов техники анаэробного культивирования привнесло новые существенные коррективы в понятие «нормальная» вагинальная микрофлора. По мере совершенствования анаэробной техники и идентификации строгих анаэробов заметно расширился спектр микроорганизмов, входящих в состав нормальной вагинальной микрофлоры [16, 17].
Однако, бактериологический метод исследования не универсален, пределы его возможностей весьма ограничены и зачастую зависят от ряда субъективных факторов, таких как оснащенность бактериологической лаборатории, качество используемых для выделения микроорганизмов питательных сред, уровень подготовки бактериологов и т.д. Поэтому результаты исследований различных авторов значительно варьируют и в настоящее время пока еще не определены четкие критерии «нормофлоры» влагалища, пограничных и патологических состояний. А это, в свою очередь, создает определенные трудности в постановке диагноза, прогнозировании тяжести течения патологического процесса и возможности его осложнений, а также в назначении адекватной этиотропной терапии.



Источник: analyz24.ru


Добавить комментарий